14.09.2021 №37

image

Ученые лаборатории белковой инженерии ИБОХ НАН Беларуси разработали новый ферментный препарат – терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу.

Этот уникальный фермент является специализированной ДНК-полимеразой, способной к безматричному синтезу ДНК. Он уже нашел применение в молекулярной биологии и диагностике: его используют для амплификации к ДНК, для синтеза меченной ДНК в TUNEL-анализе при исследованиях апоптоза, для иммуно-флуоресцентной диагностики острого лимфобластного лейкоза. Клетки лейкоза обладают повышенной активностью TdT, в связи с чем данный фермент рассматривается как молекулярная мишень для терапии ряда лейкозов. Последние годы TdT привлек внимание многих научных групп как перспективный инструмент для программируемого de novo синтеза ДНК в водной среде.

На работу с этим ферментом нас вдохновила статья в журнале Nature Biotechnology «Enzymatic DNA synthesis enters new phase», которая вышла в октябре 2020 года. В ней рассказывается о том, что в настоящее время между несколькими американскими биотехнологическими стартапами идет активная конкурентная борьба за первенство в создании метода de novo энзиматического синтеза ДНК.

Нет сомнений: рано или поздно будут разработаны и внедрены в практику подобные методы синтеза ДНК, – нужен лишь упорный труд, время и немного успеха.

Учитывая коммерческий и фундаментальный потенциал фермента, мы включили работы по его получению и исследованию в перспективные планы лаборатории в рамках задания ГПНИ «Химические технологии и материалы» и проектов БРФФИ.

Для синтеза мы выбрали аминокислотную последовательность фермента Bosbovis (бык), несмотря на то, что пространственная структура известна для TdT Musmusculus (мыши). По литературным данным фермент быка стабильнее и обладает большей активностью, это определило наш выбор. Аспирант Вероника Щур (на фото) синтезировала оптимизированный для бактерий ген TdT, добавив к нему метку аффинности для упрощения процедуры очистки. Младший научный сотрудник Юлия Буренкова создала с использованием этого гена экспрессионные векторы для синтеза фермента в бактериальных клетках и получила первые образцы ферментного препарата для испытаний. Аспирант Антон Саченко работает над получением гибридных мультидоменных ферментов на основе TdT и термостабильных ДНК-связывающих белков микроорганизмов с целью повысить стабильность фермента и улучшить его каталитические характеристики. В качестве ДНК-связывающих доменов мы выбрали белок, связывающий одноцепочечную ДНК из E. coli (ssb, Single Strand Binding protein) и белок, связывающий двуцепочечную ДНК (sso7d) из термофильного микроорганизма Sulpholobus solfataricus. Ген ssb, клонировали из генома E. coli, ген sso7d синтезировали de novo. Мы предполагаем, что ДНК-связывающий домен в составе фермента создаст возможность дополнительного контроля за его активностью, что, несомненно, может быть использовано при разработке методов программируемого безматричного синтеза ДНК. Мы также планируем использовать данный фермент (на иллюстрации – модель его структуры) при синтезе библиотек синтетических генов, над этим работает аспирант Евгений Гудный.

Параллельно изучаем изменение субстратной специфичности TdT с привлечением методов молекулярного моделирования и направленного мутагенеза. В присутствии в реакционной среде дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), фермент начинает случайным образом присоединять основания к 3′-концам двуцепочечной ДНК (дцДНК) или 3′-концу олигонуклеотида. Даже при добавлении эквимолярного количества dNTP фермент успевает присоединить несколько оснований к одной молекуле ДНК. Поэтому главная задача, которую нужно решить при создании энзиматического синтеза ДНК – это «приручить» фермент, заставить его за один реакционный цикл присоединять к растущей цепи ДНК только одно основание. Один из способов сделать это – ввести в присоединяемый dNTP легко удаляемую, но стабильную в реакционной среде защитную группу, которую после присоединения «снимать» другим ферментом или реагентом, завершая таким образом реакционный цикл. Природный фермент TdT чувствителен к модификациям дезоксирибозного кольца, и не может использовать 3′-модифицированные dNTP в качестве субстрата. Изменения в активном центре могут изменить субстратную специфичность фермента. Эта работа должна лечь в основу магистерской диссертации Андрея Жолнеровича.

Таким образом, коллекция рекомбинантных ферментов Института биоорганической химии НАН Беларуси, которую создал член-корреспондент Сергей Усанов, пополнилась еще одним ценным экземпляром. Учитывая пока все еще отсутствующие в этой области прорывные успехи американских научных коллективов, мы рассчитываем внести вклад в разработку метода энзиматического безматричного синтеза ДНК, который, несомненно, позволит сделать существенный шаг в развитии синтетической биологии и биотехнологии.

Алексей ЯНЦЕВИЧ,

заместитель директора по научной работе ИБОХ НАН Беларуси